Procedimento
Design dos primers que vão permitir a inserção do gene pretendido no plasmídeo compatível com a cianobactéria utilizada.
Transformação em E.Coli do plasmídeo com o gene OpdA e do plasmídeo com o gene homólogo, de modo a garantir um stock destes através da sua multiplicação nas células de E.Coli.
Técnica de PCR a diferentes temperaturas de modo a perceber qual seria a temperatura ideal para a amplificação do gene pretendido.
Eletroforese que permite avaliar a qualidade da amplificação em todas as temperaturas por meio de comparação, obtendo assim a temperatura pretendida.
Repetição da técnica de PCR à temperatura ideal avaliada anteriormente, de modo a obter uma maior quantidade e isolamento do gene desejado.
Eletroforese para observar se há alguma contaminação na amostra e para verificar se a amplificação foi bem sucedida e, de seguida, purificação do ADN.
Medição da concentração de ADN e clonagem, juntando o plasmídeo obtido no PCR com o plasmídeo compatível com a cianobactéria que será inserido no seu interior, por complementaridade de bases.
Repetição da técnica de clonagem com uma abordagem diferente devido à inexistência de colónias de E.Coli resultante do procedimento anterior.
Seleção, marcação e extração de colónias isoladas de E.Coli, obtidas previamente, e técnica de PCR.
Eletroforese para verificar se as células das colónias isoladas de E.Coli continham o plasmídeo no seu interior.
Extração e isolamento do plasmídeo presente nas células de E.Coli e medição da concentração de ADN do mesmo.
Passagem do plasmídeo isolado anteriormente para o interior das células de uma E.Coli específica para fazer o processo de conjugação (técnica usada para transferir o plasmídeo contido na mesma para o interior da cianobactéria).
Preparação dos meios de cultura que serão utilizados para o processo de conjugação e autoclavar (esterilizar numa autoclave) os mesmos.
Verter os meios de cultura, anteriormente preparados, em placas de Petri e na câmara de fluxo para evitar contaminações.
Processo de conjugação (passagem do nosso plasmídeo, que se encontra numa E.Coli específica para este processo, para o interior da cianobactéria).